蛋白质的磷酸化翻译后修饰是生物体内主要的调控机制，涉及诸如细胞分裂、细胞凋亡和细胞间信号转导等生物过程。许多人类疾病和蛋白磷酸化异常有关，例如乳腺癌、阿尔兹海默症等。因此在临床队列研究中，进行磷酸化蛋白质组学分析可以从磷酸化翻译后修饰的角度理解或者解释疾病发生发展，是蛋白质组学驱动的精准医学（PDPM）的重要补充工具。然而目前磷酸化蛋白质组学的样本制备过程存在耗时长、步骤冗杂且起始量蛋白需求多等一系列问题，加上临床队列研究越来越庞大，病理样本取样越来越小等特点，传统的磷酸化蛋白质组学流程很难满足目前的研究需求。

2023年11月27日，国家蛋白质科学中心（北京）贺福初院士团队在Analytical Chemistry 上发表题为“RUPE-phospho: Rapid Ultrasound-Assisted Peptide-Identification-Enhanced Phosphoproteomics Workflow for Microscale Samples”的文章。文章描述了一种非接触超声辅助的高通量微量的磷酸化蛋白质组学策略（RUPE-phospho）。该策略基于一种可控温的非接触超声仪来快速酶解蛋白，且针对微量样本优化了后续磷酸化富集流程，整个工作流程只需3小时就可完成24个磷酸化蛋白质组学样品的制备。5 μg细胞裂解液样品,可以鉴定到5325个磷酸化位点、4549个磷酸化肽段及1888个磷酸化蛋白。另外，该方法在处理小鼠冷冻切片组织（OCT组织）也取得较好结果，1~2 mgOCT包埋小鼠脑组织样本可以鉴定出9219个磷酸化位点。

文章结论

RUPE酶解法的建立和评估

为了达到更高通量，快速酶解蛋白质的目的，研究团队首先在非接触超声仪上进行了多方面的实验条件优化。最后选择了15 min酶解时间，43℃和1：1的超声ON/OFF比作为肽段鉴定数最优的酶解条件。对比于传统的过夜酶解法详细评估了RUPE法，具体来说:

1.RUPE法可以鉴定到更多的肽段数(101294 vs 84286)，但是两种方法鉴定到的蛋白数量没有明显差异(8435 vs 8432)（图1A）。

2.两种方法鉴定到的结果重叠率高，RUPE法和过夜酶解法可以共同鉴定到大约93.7%的蛋白和74.5%的肽（图1B）。

3.两种方法鉴定到的肽段性质相似性高，RUPE法和过夜酶解法鉴定的肽段长度分布和肽段亲疏水性（GRAVY）分布都十分相似，但是RUPE法鉴定到的长度大于10的肽段数明显增多（图1C和D）。

4.RUPE法相较于过夜酶解法，可以鉴定到的含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸（STY）的肽段比例有大约5%的提升。这对于后续磷酸化肽段富集并提升磷酸肽鉴定量有一定的优势（图1E）。

5.与过夜酶解定量结果相比，RUPE法5次生物重复的Pearson相关系数更高，表明RUPE法定量可靠性好（图1F）。

图 1   RUPE法与过夜酶解的对比

基于RUPE法酶解建立的磷酸化蛋白质组学流程（RUPE-phospho）

结合上述开发出来的非接触超声辅助蛋白快速酶解技术，研发团队也同时优化了磷酸化肽段富集、脱盐等一系列后续实验流程（图2A）。主要的流程优化在于：

1.优化后的流程均在低吸附的tip头中处理，减少步骤间的肽段固定损失，更有利于微量样本的操作。

2.在进行磷酸化肽段富集前，酶解完后的肽段需要进行脱盐步骤处理。研发团队使用了一种含高有机相的酸性试剂直接进行脱盐柱的肽段洗脱，该试剂兼容后续的富集过程，所以整体流程省去了其中一次转管移液和烘干操作。

3.直接省掉富集后的第二次脱盐步骤。

整体流程优化以后的RUPE-phospho流程，在对比传统的过夜酶解流程处理200 μg的HEK 293T细胞裂解蛋白后，发现磷酸化位点、磷酸化肽段和磷酸化蛋白分别提升了15.1%、28.8%和20.7%（图2B）。且这三个层面的覆盖率都达到了70%以上，鉴定到的磷酸化肽段的长度和GRAVY值分布也十分相似（图2C, D和E）。

图 2   RUPE-phospho流程概览和鉴定量结果展示

RUPE-phospho的灵敏度测试

为了探究RUPE-phospho流程处理样本的灵敏度，研发团队使用5 μg、20 μg、50 μg、100 μg和200 μg的HEK 293T细胞裂解蛋白质作为不同样本处理起始量进行评估。

发现RUPE-phospho流程不论在处理诸如200 μg级别的样本，还是低至5 μg微量的样本都有着不错的表现。并且MSfragger相较于MaxQuant软件，在磷酸化位点和磷酸化肽段鉴定数层面提升明显，特别是在诸如5 μg这样的微量样本条件下，可以从2581个位点提升至5325个位点，提升鉴定数一倍多（图3A）。在磷酸化蛋白质鉴定数和磷酸肽富集效率层面，两种搜库软件没有明显区别（图3B）。

图 3   RUPE-phospho在不同蛋白起始量的表现

RUPE-phospho流程在小鼠OCT组织上的应用

研究团队在处理OCT组织样本时，再次利用到了非接触超声仪的优势，将原来组织蛋白提取、蛋白的还原烷基化和蛋白酶解三个步骤进行一步法操作，只在15 min内即可做到从组织碎屑到澄清的肽段溶液（图4A）。测试样本用到了小鼠脑、肝、脾脏、肺和胃等5种不同形态的组织，用来模拟临床上可能遇到的各种样本类型。所有的样本组织都在100 mg湿重左右，大约可以提取到100 μg蛋白。结果发现，在磷酸化位点层面，5种组织鉴定数都超过了6000，小鼠脑鉴定数最多，可以达到9219个位点；在磷酸化肽段层面，5种组织鉴定数都超过了5500，小鼠脑鉴定数最多，可以达到7433个肽段；在磷酸化蛋白层面，5种组织鉴定数都超过了2000（图4B）。

图 4   RUPE-phospho在OCT样本的工作流程示意图和结果展示

总结

本研究提供了一个利用非接触超声辅助来加快蛋白酶解，且可以有效提高肽段鉴定量的方法——RUPE法，并进一步优化磷酸肽富集流程开发出了RUPE-phospho流程。相较于传统的过夜酶解，该流程可以增加20%多磷酸化肽段鉴定数。RUPE-phosoho工作流程不仅提高了磷酸化蛋白质组学的处理通量，还很好地满足处理微量样品的要求，具有一定的自动化处理样本潜力，在临床珍贵样本的分析有着重要的应用前景。

作者介绍

国家蛋白质科学中心（北京）的贺福初院士/王冬雪博士为论文共同通讯作者，国家蛋白质科学中心（北京）的黄元轩硕士研究生和邵先锋博士研究生为论文共同第一作者。

原文链接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c02623